Comment choisir un kit d’isolement de protéines membranaires

Les protéines de la membrane plasmique (MP)

jouent un rôle essentiel dans divers processus physiologiques et pathologiques. La transduction du signal, le transport moléculaire et les interactions cellule-cellule sont toutes médiées par les protéines MP. Très variées, les protéines MP incluent les récepteurs de neurotransmetteurs, les protéines G, les transporteurs, les canaux ioniques voltage-dépendants, les antigènes CD et de nombreuses cibles de médicaments. Détecter et caractériser le trafic intracellulaire de protéines MP est essentiel pour comprendre les systèmes biologiques.

L’isolement / purification

est généralement la première étape de la caractérisation et du profilage des protéines MP. Cependant, il s’est avéré particulièrement difficile en raison de leur faible abondance et de l’inter-connectivité des systèmes membranaires intracellulaires. Les protéines MP sont traditionnellement isolées par ultra-centrifugation sur gradient de densité de saccharose [1,2]. Le protocole est fastidieux et prend du temps, des heures voire des jours. Ces dernières années, les kits commerciaux pour l’isolement et la caractérisation de protéines MP sont de plus en plus cités dans les publications en raison de leur facilité d’utilisation et de leur rapidité. Cependant, il est montré que l’efficacité de ces kits varie de manière significative en raison des différents mécanismes d’action, et selon les applications spécifiques en aval. Il est ainsi délicat de choisir un kit approprié pour un projet de recherche particulier. Dans ce contexte, nous essayons de résumer les avantages et les inconvénients de certains des kits d’isolation de protéines membranaires communément utilisés et de fournir un guide général pour la sélection de kits d’isolation de protéines membranaires du commerce.

Les kits d’isolation de protéines membranaires disponibles dans le commerce peuvent être classés selon leurs mécanismes d’action ou des principes d’isolation, en quatre catégories :

1. Extraction de phase liquide.

Le kit d’extraction de protéines membranaires de 2 marques multinationales (T, M) sont typiques de cette classe. Les cellules / tissus sont d’abord lysées par un tampon de lyse, les protéines solubles et les fractions insolubles sont séparées par centrifugation. Les protéines membranaires sont en outre extraites de la fraction insoluble par un tampon d’extraction exploitant le caractère hydrophobe des protéines membranaires. Ces kits sont relativement simples et rapides (environ 1h). Le protocole génère deux fractions distinctes: la fraction cytosolique et la fraction de protéines membranaires, mais le protocole n’indique pas clairement si un détergent est utilisé pour la lyse cellulaire. Les protéines membranaires extraites sont dérivées de tous les systèmes membranaires tels que les mitochondries, RE, Golgi et les noyaux. Les extraits de ces kits sont en fait des protéines membranaires totales. On peut s’attendre à ce que l’extraction des protéines membranaires soit complète ou non selon les échantillons, en particulier pour les protéines qui traversent la membrane plusieurs fois. Il n’est pas clair si les protéines associées à la membrane restent fixées et intactes dans les protéines de membrane extraites.

2. Marquage à la surface cellulaire.

Une expérience typique utilisant un kit de ce type (P, Q) implique le marquage de protéines de surface cellulaire par la sulfo-NHS-biotine. Après marquage, les cellules sont lysées et le lysat cellulaire est déposé sur une phase solide conjuguée à l’avidine. Les protéines membranaires plasmiques biotinylées sont éluées en utilisant un tampon d’élution dénaturant. En théorie, cette approche devrait produire des protéines membranaires plasmiques hautement purifiées. En réalité, cette méthode souffre de nombreux inconvénients. Par exemple, toutes les protéines à la surface des cellules ne seront pas marquées. Le profil protéique d’une culture cellulaire donnée peut changer avec le temps et les conditions de la culture. Les encombrements stériques et le manque d’amines primaires peuvent interférer avec le marquage des protéines, entraînant des résultats incohérents. L’utilisation d’une solution d’élution dénaturée limite également l’utilisation des protéines isolées.

3. Séparation de phases.

Les mécanismes d’action de ce type de kits (A, L) sont similaires à ceux d’une séparation de phases liquides précédemment publiée [3] mais tire parti de la séparation différentielle de la membrane plasmique dans la phase supérieure et d’autres membranes (telles que ER, Golgi et mitochondries) dans la phase inférieure : Il y a enrichissement et isolement des protéines de la membrane plasmique. Les échantillons de cellules / tissus en culture sont d’abord homogénéisés à l’aide d’un homogénéisateur Dounce. Les échantillons lysés sont soumis à de multiples extractions et centrifugations conduisant à des fractions totales de protéines membranaires, cytosoliques et de la membrane plasmique. Les avantages de la méthode sont de pouvoir isoler les protéines de la membrane plasmique sans détergent et le protocole est relativement simple et rapide (environ 1 à 1,5 heure). Cependant, un grand nombre de cellules est nécessaire (50-100 millions / échantillon) et le rendement est relativement faible (1-100ug / échantillon). Un fabricant a affirmé que la pureté des protéines de la membrane plasmique est supérieure à 90%, mais aucune donnée à l’appui n’est présentée.

4. Fractionnement subcellulaire à base de colonne de centrifugation.

Il s’agit d’une technologie d’isolement de protéines de la membrane plasmique de nouvelle génération d’Invent biotechnologies, qui propose une méthode simple et rapide de fractionnement subcellulaire sans homogénéisateur Dounce. Les cellules / tissus passent à travers une cartouche filtrante spécialisée. Les membranes plasmiques des cellules se rompent au cours du processus et les protéines, les organites, la membrane plasmique et les protéines cytosoliques intacts sont libérés dans une suspension qui est ensuite séparée en cinq fractions: membrane totale, membrane plasmique, cytosolique, des organelles et du noyau. Grâce à l’utilisation de la cartouche filtrante et d’un système tampon unique, il est possible d’obtenir un rendement élevé en protéines de la membrane plasmique en condition native en moins d’une heure avec un minimum de contaminations croisées. La protéine de la membrane plasmique native isolée peut être utilisée pour toutes les expériences en aval. Contrairement à tous les autres kits décrits ci-dessus, le kit d’isolement de la membrane plasmique à base de colonne de centrifugation peut également être utilisé pour l’isolement de protéines végétales MP. Ce kit devient de plus en plus populaire, comme en témoignent les données des publications sélectionnées ci-dessous.

Le choix d’un kit d’isolement de protéines membranaires dépend principalement des applications spécifiques en aval.

Certains kits ont des applications beaucoup plus larges que d’autres. Par exemple, les protéines MP natives sans détergent peuvent être utilisées pour presque toutes les applications, tandis que celles isolées par le kit P d’isolement de protéines de surface cellulaire sont uniquement recommandées pour le Western blot. Les exemples suivants illustrent ce que l’on attend d’un bon kit de fractionnement subcellulaire. De nombreuses protéines MP sont présentes à une concentration relativement faible. Parfois, il est difficile de détecter et de quantifier les protéines membranaires sans isolement ni enrichissement. Les données suivantes [4] démontrent clairement l’effet de l’enrichissement en protéines MP sur la détectabilité du SGLT1 à partir d’échantillons cardiaques humains. Les signaux des protéines Na+/K+ ATPase et SGLT de la membrane plasmique sont significativement améliorés dans la fraction de la membrane plasmique par rapport à la fraction membranaire totale.

Kutluay et al. [5] ont étudié les modifications de la liaison de l’ARN-Gag à l’ARN viral lors de l’assemblage du virion du VIH-1. L’une des expériences clés consiste à montrer les différentes formes du produit d’addition de Gag-ARN présents dans différents emplacements subcellulaires. Les cellules 4SU-fed 293T ont été transfectées avec le plasmide proviral VIH-1 et fractionnées par un kit d’isolement de protéines de la membrane plasmique basé sur une colonne de centrifugation. Les fractions cytosoliques et de la membrane plasmique ont été analysées en Western Blot et par immunoprécipitation. Les résultats indiquent que la protéine Gag cytosolique est principalement monomèrique, alors que la protéine Gag sur la membrane plasmique est multimérisée (B). Cette conclusion dépend en grande partie de la qualité de séparation entre fractions cytosoliques et membranaires plasmatiques (A). Si une contamination croisée significative avait été présente, la conclusion serait discutable.

Les études de la distribution intracellulaire des protéines cibles et leur trafic dans différentes conditions expérimentales (par ex entre différents groupes expérimentaux traités) sont importantes pour la recherche biomédicale. La protéine cible peut être suivie par fractionnement subcellulaire suivi d’une méthode de détection spécifique. Leung et al. [6] ont étudié l’effet de la PRL-3 sur le trafic de protéines ULBP2 par fractionnement cellulaire. La lignée cellulaire du cancer du côlon humain HCT 116 a été traitée avec 40 µM de RPL-3 et a été soumise à un fractionnement subcellulaire en utilisant un kit d’isolement de la membrane plasmique basé sur une colonne de centrifugation. Les résultats ont montré une nette séparation des fractions MP, des organelles et du cytosol. Le traitement de la cellule avec le produit chimique PRL-3 entraîne la translocation de la membrane plasmique en fraction d’organites. Là encore, cette conclusion repose sur une séparation nette des différentes fractions sous-cellulaires.

Comme démontré par Jose et al. [7], le kit d’isolement de protéines MP par colonne de centrifugation (SM-005, Invent Biotechnologies) peut fractionner les cellules endothéliales en culture en différentes fractions sous-cellulaires, ER et Golgi.

Le degré de contamination croisée est évidemment l’un des facteurs les plus importants pour la sélection d’un kit d’isolement de protéines membranaires. La performance des kits commerciaux diffère de manière significative sur ce critère. Bunger et al. [8] ont comparé cinq kits commerciaux d’isolement de protéines membranaires au niveau de la contamination croisée entre les fractions cytosoliques (Cyt) et membranaires (Mem) et ont montré que tous les kits testés présentaient une contamination croisée, évidente pour deux marqueurs couramment utilisés (ATPase et GAPDH). Les performances des kits varient de manière significative lorsque la cadhérine est utilisée comme marqueur de la MP. Il est fortement recommandé de choisir un kit d’isolement de protéines membranaires en se référant aux publications à fort facteur d’impact.

En résumé, les kits d’isolement de protéines membranaires sont des outils précieux pour les chercheurs. Par rapport aux méthodes traditionnelles, un bon kit commercial permet gagner du temps, augmente l’efficacité et accélère le processus de découverte. Mais il faut bien choisir ce kit, principalement sur les performances pour des expériences aval similaires. La taille de l’échantillon requise est à prendre en compte, en particulier lorsque le nombre de cellules disponibles est un facteur limitant. Dans des conditions idéales, un bon kit commercial devrait fournir aux chercheurs les résultats attendus sans problème, ni optimisation significative. Un autre critère consiste à apprécier si le kit peut donner aux chercheurs un avantage en termes de facilité d’utilisation, de rapidité, de performance et de coût.

Références:

1. Neville, D. M, (1960) The isolation of a cell membrane fraction from rat liver. J. Biophy. Biochem. Cyto. 8: 413-421.
2. Touster, O. et al. (1970) Isolation of liver plasma membranes. J. Cell Bio. 47:604-618.
3. Yoshida, S. et al. (1983) Partitioning of membrane particles in aqueous two-polymer phase system and its practical use for purification of plasma membranes from plants.Plant physiol. 72:105-114.
4. Kashiwagi Y. et al. (2015) Expression of SGLT1 in Human Hearts and Impairment of Cardiac Glucose Uptake by Phlorizin during Ischemia- Reperfusion Injury in Mice. PLoS ONE 10(6):e0130605.
5. Kutluay, S., et al. (2014). Global Changes in the RNA Binding Specificity of HIV-1 Gag Regulate Virion Genesis, Cell (2014)
6. Leung W-H. et al. (2015). PRL-3 Mediates the protein Maturation of ULBP2 by regulating the tyrosine phosphorylation of HSP60.The Journal of Immunology.doi:10.4049/jimmunol.1400817.
7. Vazquez-Medina J.P. et al. (2016). The phospholipase A2 activity of peroxiredoxin 6 modulates NADPH oxidase 2 activation vialysophosphatidic acid receptor signaling in the pulmonary endothelium and alveolar macrophages. The FASEB Journal. doi: 10.1096/fj.201500146R
8. Bunger, S. et al. (2009) Comparison of five commercial extraction kits for subsequent membrane protein profiling. Cytotechnology. 61:153-159.